Higiena hodowli
Wskazania do badania i pobieranie próbek
Zaburzenia płodności klaczy mogą być spowodowane obecnością bakterii w narządach rozrodczych. Podczas naturalnego krycia bakterie te mogą doprowadzić do zakażenia ogiera. Aby zapewnić dobrą płodność, macica i szyjka macicy muszą być wolne od czynników chorobotwórczych lub warunkowo patogennych.
Aby stwierdzić obecność patogenów w narządach rozrodczych wymagane jest wykonanie hodowli bakteriologicznej i ewentualnie mykologicznej z wymazu pobranego w sterylnych warunkach.
U klaczy, które po niezakłóconym porodzie urodziły zdrowe źrebię i które nie wykazują klinicznych objawów infekcji narządów płciowych, jak również u trzyletnich niekrytych dotychczas klaczy, można przyjąć, że w macicy zwykle nie ma patogenów, które mogłyby zaburzać płodność. W takich przypadkach nie przeprowadza się badania mikrobiologicznego, choć często jest ono wymagane przez właściciela ogiera w chowie naturalnym.
Bezwzględnie konieczne jest wykonanie hodowli wymazów w następujących przypadkach:
- u klaczy, które nie były kryte albo pomyślne pokryte lub zapłodnione w poprzednim roku;
- występują objawy kliniczne chorób dróg rodnych;
- klacze poroniły;
- źrebienie i wydalanie łożyska nie przebiegło prawidłowo;
- klacze w bieżącym sezonie rozrodczym przechodziły ruję dwukrotnie.
Przed pobraniem wymazu należy zawsze wykluczyć ciążę! Idealny czas to okres rui, gdy szyjka macicy jest otwarta. Dla uzyskania wiarygodnego wyniku bakteriologicznego bardzo ważne jest, aby wymazówka nie miała kontaktu ze skórą, przedsionkiem pochwy ani błoną śluzową pochwy. W miejscach tych mogą znajdować się patogeny, które nie występują w macicy.
W celu uzyskania jak najlepszych wyników badania, pobieranie próbek powinno w każdym przypadku odbywać się za pomocą wziernika.
Aby ułatwić przejście przez kanał szyjki macicy, można użyć kleszczyków szyjkowych. Podczas pobierania próbek za pomocą wziernika można jednocześnie ocenić błonę śluzową pod kątem oznak stanu zapalnego lub obecności złogów.
Zdolność reprodukcyjna: wyniki badania bakteriologicznego
Następujące bakterie są klasyfikowane jako chorobotwórcze w badaniu higieny hodowli; w ich przypadku leczenie jest zalecane przed kryciem, nawet jeśli klacze są klinicznie zdrowe:
- paciorkowce beta-hemolityczne
- Staphylococcus aureus
- Escherichia coli
- Pseudomonas aeruginosa
- Klebsiella spp.
- Raoultella ornithinolytica (wcześniej Klebsiella ornithinolytica)
- Actinobacillus equuli
- Bordetella bronchiseptica
- Rhodococcus hoagii (wcześniej R. equi)
Różnicowanie patogenów odbywa się na podstawie morfologii hodowli i metodą MALDI-TOF.
Jeśli bakterie Escherichia coli są obecne i nie mają one właściwości hemolitycznych, nadal zaleca się leczenie przed kryciem, jeśli liczba bakterii jest wysoka i wykryto je w czystej hodowli. Wyniki badań mikrobiologicznych należy zawsze oceniać w korelacji ze zmianami klinicznymi obserwowanymi w badaniu ginekologicznym.
W takich przypadkach prowadzący lekarz weterynarii decyduje, czy klacz może być kryta, czy też konieczne jest np. leczenie lub okres karencji. Jeśli wykryte patogeny są istotne z punktu widzenia zdolności reprodukcyjnej, wykonywany jest antybiogram w celu sprawdzenia lekowrażliwości.
Inne bakterie, które są uważane za niespecyficzne, wymienione są w wyniku badania, ale nie zostanie wykonane dla nich badanie lekowrażliwości.
Badanie bakteriologiczne zwykle trwa 2-5 dni, włączając w to antybiogram.
Analizie poddano próbki przesłane na badanie higieny hodowli w okresie styczeń 2021 – sierpień 2022. Zwykle na zleceniu nie było informacji o objawach klinicznych.
Patogeny chorobotwórcze wykryto w ok. 30% dostarczonych próbek. Spośród bakterii sklasyfikowanych jako chorobotwórcze najczęściej wykrywano paciorkowce beta-hemolityczne (21,79%).
W 1,70% próbek znajdowały się bakterie E. coli niehemolityczne, a w 1,19% próbek E. coli o właściwościach hemolitycznych występowały w dużej ilości obecne w czystej kulturze.
Chociaż Staphylococcus aureus był dopiero czwartym najczęściej występującym drobnoustrojem (0,81%), warto wspomnieć, że 24% wyizolowanych szczepów było opornych na metycylinę.
Taylorella equigenitalis
Zakaźne zapalenie macicy klaczy (ang. contagious equine metritis, CEM) jest podlegającą zgłoszeniu chorobą weneryczną, którą wywołuje bakteria Taylorella equigenitalis. Zakażone ogiery są zwykle bezobjawowymi nosicielami, natomiast klacze mogą chorować na zapalenie błony śluzowej macicy (endometriozę) i zaburzenia płodności, chociaż u nich też zdarzają się też zakażenia bezobjawowe. Zgodnie z dyrektywą Rady 92/65/EEC wymazy do badania należy pobierać od klaczy z co najmniej dwóch miejsc – dołu i zatoki łechtaczki. Obok hodowli bakterii, drugą dostępną metodą diagnostyczną jest test PCR. Niezależnie od metody, do badania wykorzystuje się wyłącznie wymazy z dodatkiem aktywnego węgla (podłoże Amies).
Hodowlę bakteriologiczną należy rozpocząć przed upływem 24 godzin od pobrania materiału (48 godzin w przypadku próbki schłodzonej w czasie transportu). W przypadku badań PCR nie powinno upłynąć więcej niż 48 godzin między pobraniem próbki a rozpoczęciem przeprowadzeniu testu. Należy pamiętać, że dla każdej metody wymagany jest osobny wymaz.
U koni islandzkich przed kryciem w ramach badania higieny hodowli wymagane jest dodatkowo wykonanie bakteriologiczne w celu wykluczenia Taylorella equigenitalis.
Hodowla w kierunku Taylorella equigenitalis trwa około 7 dni. Zaletą PCR jest szybsza diagnostyka (2-3 dni robocze).
Zdolność reprodukcyjna: badanie mykologiczne
Zwłaszcza jeśli podczas oględzin błony śluzowej pochwy stwierdza się białawy nalot, należy rozważyć zakażenie grzybicze. W przypadku masywnej infekcji macica jest zwykle znacznie wypełniona szaro-śluzową i mętną wydzieliną. Błona śluzowa szyjki macicy i endometrium są brudno-ciemnoczerwone i wyraźnie zaognione.
Najczęściej izolowanymi z drożdżakami w dodatnich hodowlach mikologicznych dostarczonych do naszego laboratorium, były drożdżaki z rodzaju Candida parapsilosis (3,5%), w dużej ilości i czystych hodowlach.
Candida parapsilosis może zainfekować skórę i rogówkę, a także błony śluzowe. Zachodzi obawa, że u ludzi drożdżaki te są czynnikiem sprawczym zapalenia wsierdzia po zabiegu cewnikowania.
Czynnikiem predysponującym do zakażenia drożdżakami jest przebyta długotrwała antybiotykoterapia, którego główną przyczyną może być domaciczna aplikacja antybiotyków. Niewykluczone jest, że wpływ mają również rozcieńczalniki nasienia zawierające antybiotyki jako element sztucznej inseminacji.
Najczęściej izolowanymi pleśniami były Mucor spp. i różne gatunki Aspergillus, ale ich ilość była zwykle niska. Jeśli nie są liczne (zwłaszcza dotyczy to pleśni), należy zadać sobie pytanie, czy dodatni wynik hodowli nie jest spowodowany zanieczyszczeniem.
Zdolność reprodukcyjna: podsumowanie
W okresie rozrodczym ważna jest ocena przydatności hodowlanej wszystkich klaczy przeznaczonych do hodowli. Obejmuje to nie tylko badanie ginekologiczne, ale także badanie mikrobiologiczne wymazów z szyjki lub z macicy.
Rozpoczęcie badania higieny hodowli zaleca się na wczesnym etapie przedsezonowym, aby nawet zwierzęta, u których wykryto obecność patogenów, można było doprowadzić do zdolności reprodukcyjnej za pomocą odpowiedniego leczenia bez straty cennego czasu. Jeśli wynik badania jest dodatni, leczenie należy przeprowadzić przed kryciem. Skuteczność leczenia można kontrolować najwcześniej po 10 dniach od zakończenia leczenia, wykonując nowe badanie bakteriologiczne i/lub mykologiczne. Jeśli wyniki badania są prawidłowe, następna ruja może być wykorzystana do rozrodu. Przy dobrym rozplanowaniu i w idealnych okolicznościach wszystkie procedury diagnostyczne i terapeutyczne zostaną zakończone przed rozpoczęciem sezonu rozrodczego.
Diagnostyka hormonalna w ciąży
Po zakończeniu niezbędnych przygotowań związanych ze zdolnością reprodukcyjną zdrowe klacze mogą zostać poddane inseminacji lub kryciu. Badania towarzyszące rui mają charakter wyłącznie kliniczny, są przeprowadzane i dokumentowane jako kontrola pęcherzyków w palpacyjnym badaniu rektalnym – ewentualnie uzupełnionym badaniem ultrasonograficznym.
Kontrole ciąży są również zwykle wykonywane przez badanie rektalne uzupełnione usg, zwłaszcza na wczesnych etapach. Tylko w ten sposób można uzyskać obraz żywego zarodka we wczesnej ciąży i wykluczyć np. ciąże bliźniacze.
Badanie manualne nie zawsze jest możliwe w praktyce. W przypadku koni małych/ras miniaturowych, pacjentów niewspółpracujących, zwierząt dzikich i zwierząt w ogrodach zoologicznych, a także w przypadku prawdopodobieństwa wystąpienia zmian chorobowych w odbytnicy, należy unikać badania rektalnego.
W takich przypadkach możliwe jest oznaczenie hormonów specyficznych dla okresu ciąży, które wykazują typowe stężenia w określonych fazach.
Dostępne są dwa hormony: gonadotropina surowicy źrebnych klaczy (PMSG) = gonadotropina kosmówkowa (eCG) i siarczan estronu.
PMSG/eCG
Z niewielkimi różnicami osobniczymi hormon ten jest wydzielany przez endometrium w przybliżeniu między 35. a 120. dniem ciąży. Zalecane jest pobranie próbki między 45. a 100. dniem po owulacji. Najwyższe stężenie PMSG jest mierzone między 60. a 75. dniem. W „obszarach granicznych” zalecanych widełek czasowych mogą wystąpić wyniki wątpliwe, które należy potwierdzić badaniami kontrolnymi. Jeśli dojdzie do resorpcji płodu, co może się zdarzyć szczególnie w tym okresie, endometrium przez następne tygodnie wciąż będzie produkować PMSG, nawet jeśli nie ma już żywego płodu. Zdarzają się zatem fałszywie dodatnie wyniki PMSG. Co więcej, chore klacze nie przechodzą rui w tym czasie.
Siarczan estronu
Hormon ten wytwarzany jest przez nienaruszoną jednostkę płodowo-matczyną, a więc wskazuje na żywotność płodu. Od około 40. dnia ciąży hormon ten jest wydzielany w coraz większych ilościach. W tych wczesnych stadiach nie jest jednak możliwe wiarygodne różnicowanie z cyklicznym wydzielaniem estrogenów.
Zalecane jest oznaczanie siarczanu estronu od 110. dnia ciąży, ponieważ ciężarne klacze wykazują w tym czasie znacznie wyższy poziom tego hormonu. Dodatkowo, klacze, u których wcześniej stwierdzono źrebność na podstawie badania PMSG, powinny być teraz ponownie sprawdzone poprzez badanie siarczanu estronu. Badanie siarczanu estronu można wykonać również w moczu.
Klacze z wątpliwym lub niejednoznacznym wynikiem badania powinny zostać ponownie zbadane po 3 do 4 tygodniach.
Jeśli wynik badania jest ujemny u klaczy źrebnych na pewno dłużej niż 110 dni, mogło dojść do uszkodzenia płodu/łożyska. W takich przypadkach niezbędne jest badanie rektalne lub badanie USG.
Progesteron
Progesteron jest hormonem ciałka żółtego. Test jest przydatny tylko między 18. a 21. dniem po owulacji – zakładając, że klacz ma stabilny, 21-dniowy cykl. Ponieważ test nie rozróżnia ciałka żółtego w cyklu od ciąży, wykrycie aktywnej funkcji ciałka żółtego oznacza jedynie, że klacz nie wchodzi w okres rui w oczekiwanym czasie.
dr Anton Heusinger oraz dr Antje Wöckener
Lektura uzupełniająca
- Tibary A, Pearson L, Fite C. Chapter 8 – Reproductive Tract Infections. W: Debra C. Sellon, Maureen T Long, Hrsg. Equine Infectious Diseases, 2nd Edition, 2014. S. 84-106.
- Heusinger A, Woeckener A. Bakteriologische Untersuchungen zur Zuchthygiene bei der Stute- Enke Verlag Pferdespiegel. 2013; 4: 150-151.
- Aurich C. Fortpflanzungsstörungen beim Hengst und Deckinfektionen. W: Reproduktionsmedizin beim Pferd. Aurich C, Hrsg. Stuttgart: Parey, 2005. S. 267-296.
- Döcke F. Veterinärmedizinische Endokrinologie. Jena: G. Fischer, 3. Auf- lage, 1994.
- Hoffmann B, Gentz F, Failing K. Investigations into the course of progesterone-, oestrogen- and eCG-concentrations during normal and impaired pregnancy in the mare. Reprod Domest Anim. 1996; 31: 717-723.