Aktualizacja na temat mutacji BRAF i testów komplementarnych BRAF

Nowotwory urotelialne i rak prostaty

U psów zarówno nowotwory urotelialne (UCa) pęcherza moczowego i cewki moczowej, jak i raki prostaty (PCa) są wysoce złośliwymi nowotworami, które często są diagnozowane stosunkowo późno (np. w badaniu USG, Rys. 1) i mają złe rokowania. Poprzez badanie obecności mutacji V595E w genie BRAF diagnozę można postawić wcześniej, wykorzystując do badania osad moczu.

Nowy dodatkowy test może zostać zastosowany, jeśli nie wykryto mutacji BRAF, a czułość badania ogólnego wymaga zwiększenia. W laboratorium Laboklin ten złożony test określany jest jako test BRAF Comp.

W opracowaniu tym omówiono oba testy.

Mutacja BRAF^V595E

Wariant BRAF V595E pochodzi z medycyny ludzkiej i został po raz pierwszy zbadany w wielorakich guzach psów w 2015 roku przez Mochizuki i in. W przeciwieństwie do ludzi, u których mutacja występuje głównie w czerniakach złośliwych, guzach jajników, tarczycy i rakach jelita grubego, Mochizuki i in. (2015) wykazali, że u psów mutacja ta najczęściej występuje w nowotworach urotelialnych i rakach prostaty.

Mutacja BRAF^V595E jest somatyczną mutacją na chromosomie 16, która może być wykryta jedynie w komórkach nowotworowych. Mutacja ta prowadzi do rozwoju nowotworu poprzez trwałą aktywację szlaku MAP kinazy.

Wskazania

Wskazaniami do badania w kierunku obecności mutacji BRAFV^595E mogą być:

• Wczesne wykrywanie u ras predysponowanych (więcej w tekście poniżej).
• Unikanie inwazyjnego pobierania próbek poprzez badanie moczu (osad).
• Unikanie powtarzanych inwazyjnych pobrań próbek w przypadkach wątpliwych diagnoz histopatologicznych i cytologicznych.
• Ukierunkowana terapia (np. Sorafenib; Chon i in. 2024) w wybranych przypadkach pozytywnych dla BRAF.

Możliwe materiały do badań

• Tkanki (np. biopsje utrwalone w formalinie, co najmniej 5 mm).
• Preparaty cytologiczne, np. bogate w komórki nowotworowe biopsje cienkoigłowe lub osad moczu (co najmniej 2 preparaty).
• Mocz (1 ml osadu moczu, zalecenie: spontanicznie oddany mocz poranny).

Dzięki wysoce czułemu PCR techniką emulsyjną (digital droplet – ddPCR) wystarczy jedynie 2 komórki nowotworowe z mutacją BRAF^V595E, aby potwierdzić diagnozę nowotworu.

Ograniczenia metodologiczne

Analizy rutynowe materiałów w kierunku mutacji BRAF^V595E w ostatnich sześciu latach wykazały, że w około 10% przypadków nie udało się wyizolować DNA. Głównie miało to miejsce, gdy do badania przesyłano nieodwirowany mocz zamiast osadu. DNA znajduje się w komórkach, więc ilość komórek nabłonkowych w próbce musi być wystarczająca aby wyizolować odpowiedniej jakości DNA. Oczywiście w próbce moczu może być wykryte wolne, pozakomórkowe DNA, ale nie może być to wyznacznikiem przy doborze materiału do badania. W rzadkich przypadkach obecne w próbce inhibitory mogą uniemożliwiać izolację DNA nawet przy wystarczającej ilości komórek.

Bakteriologiczny przerost w moczu zwykle nie stanowi problemu dla wykrycia mutacji BRAF^V595E.

Specyficzność i czułość

Specyficzność diagnostyki mutacji BRAFV595E wynosi 100%, ponieważ mutacja BRAF nie była wykrywana u psów z zapaleniem pęcherza, polipami pęcherza czy innymi podobnymi zmianami. Dotyczy to również raków prostaty, ponieważ mutacja BRAF^V595E nie została wykryta w łagodnym przeroście prostaty, metaplazji płaskonabłonkowej ani atrofi prostaty (Mochizuki i in. 2015a). W zależności od badania oraz rasy psów, czułość wykrywania mutacji BRAF w UCa wynosi 71%, a w PCa 61%. Nawet wczesne stadia (dysplazja) UCa z mutacją BRAF były wykrywalne w jednym studium przypadku (Chambers i in. 2024).

Aktualne analizy rutynowego materiału w LABOKLIN na przestrzeni ostatnich 6 lat wykazały, że odsetek próbek pozytywnych na obecność mutacji BRAF w przesłanym materiale jest wyjątkowo wysoki u niektórych ras terierów (Rys. 2), owczarków szetlandzkich i beagli. Nie oznacza to jednak nic na temat czułości, ponieważ brak informacji o tym, czy przypadki negatywne rzeczywiście miały nowotwór. Te obserwacje wskazują jednak, że mutacja regularnie występuje w próbkach od tych ras.

Interpretacja wyniku

Tylko wynik pozytywny jest rozstrzygający dla rozpoznania nowotworu.

Jeśli w próbce nie można wykryć mutacji BRAF, możliwe są następujące scenariusze:

• Nie ma UCa / PCa (np. polip, łagodny przerost).
• W próbce nie ma zmutowanych komórek, ale nowotwór jest obecny (wątpliwa reprezentatywność próbki, np. cytologia/mocz ubogi w komórki).
• Mutacja BRAF^V595E nie powoduje nowotworu.

Nowy test CNA może być pomocny (patrz poniżej).

Nowość: BRAF Comp.

LABOKLIN wprowadził dodatkowy test genetyczny (CNA) do diagnostyki raków pęcherza moczowego, tworząc pełny panel BRAF Comp. Analiza CNA opiera się na wykrywaniu zmienionej liczby specyficznych segmentów genów.

Zasadniczo, zmiany w genach strukturalnych mogą prowadzić do utraty lub pomnożenia fragmentów genów (zmiana liczby kopii, CNA) – Rys. 3.

Zmiana liczby kopii (Copy Number Alteration CNA) w raku urotelialnym psa

Duplikacje na chromosomach 13 i 36 lub delecje na chromosomie 19 stwierdzono w >75% przypadków psich nowotworów urotelialnych, z czego >93% miało dwie lub więcej takich zmian liczby kopii genów (Shapiro i in. 2015). Zmiany te nie występowały w próbkach moczu od psów z infekcjami dróg moczowych, zapaleniem pęcherza lub łagodnymi polipami pęcherza (Mochizuki i in. 2016).

Zmiany te nie są wykrywalne w rakach prostaty u psów.

Poprzez ilościowe określenie liczby kopii genów można obecnie zidentyfikować nowotwory urotelialne, które nie mają mutacji BRAF^V595E. Złożony test jest oferowany jako BRAF Comp. przez LABOKLIN i odpowiada testowi CADET® BRAF-PLUS w USA.

Jednak zmieniona liczba kopii genów nie jest powiązana z mutacją BRAF. Jest to niezależne zjawisko molekularno-genetyczne, które można wykryć jedynie w komórkach nowotworowych psich raków urotelialnych. Konsekwencje molekularne na poziomie białek lub w obrębie szlaków sygnałowych nie zostały jeszcze zbadane. Na ile możliwe jest dokonanie prognoz terapeutycznych lub prognostycznych u psów z tymi zmianami liczby kopii genów, pozostaje do ustalenia. 

Ograniczenia metodologiczne

Zasadniczo materiał już przesłany do analizy mutacji BRAF (patrz wyżej) może być wykorzystany do analizy CNA.

ALE: Wymagana jest lepsza jakość DNA, ponieważ analizowane są nie tylko mutacje punktowe BRAF^V595E, ale także bardziej obszerne segmenty genów. Dlatego potrzebna jest próbka dobrej jakości. Istnieje ryzyko, że analiza CNA nie da użytecznych wyników, jeśli mocz zawiera mało komórek i/lub występuje przerost bakteryjny.

Z tego powodu zaleca się najpierw przeprowadzenie analizy mutacji BRAF^V595E, a dopiero w przypadku wyniku negatywnego rozważenie analizy CNA. Ponieważ wyniki testów molekularno-genetycznych są znane dopiero po zakończeniu analizy, badanie jest w pełni płatne, nawet jeśli mimo wielokrotnych testów nie udało się uzyskać użytecznego wyniku.

Podsumowanie

Badanie mutacji BRAF jest bardzo specyficzną metodą (100%) wykrywania raków urotelialnych i prostaty u psów. Nowo opracowany test na zmiany w liczbie kopii specyficznych fragmentów genów (CNA) zwiększył czułość molekularno-genetycznej diagnostyki raków urotelialnych.

PD Dr. Heike Aupperle-Lellbach, Alexandra Kehl